首都医科大学三博脑科医院病理科 姚坤 段泽君 边宇 马忠 齐雪岭

【摘要】目的 观察少突胶质细胞起源肿瘤及少突-星形细胞起源肿瘤染色体1p /19q杂合性缺失与人IDH1-R132H突变蛋白表达的相关性，探索预测少突胶质细胞起源肿瘤及少突-星形细胞起源肿瘤化疗敏感性的分子标志物。方法 选择病理学诊断为各类型和级别的少突胶质细胞起源肿瘤及少突-星形细胞起源肿瘤75例，采用荧光原位杂交方法检测染色体1p/19q 杂合性缺失，免疫组织化学法检测其IDH1-R132H突变蛋白表达。结果 75例少突胶质细胞起源肿瘤及少突-星形细胞起源肿瘤1p/19q 杂合性缺失为37例(37/75，49.3%)，其中34例1p和19q同时发生缺失，1p缺失与19q缺失二者密切相关(P<0.01)。在少突胶质细胞瘤(WHO Ⅱ级)中，1p/19q 杂合性缺失检出率比间变型少突胶质细胞瘤(WHOⅢ级)高，但差异无显著性。少突胶质细胞起源肿瘤(WHOⅡ级和WHOⅢ级)中1p/19q杂合性缺失率高于少突-星形细胞起源肿瘤(WHOⅡ级和WHOⅢ级)(P<0.05)。而且少突胶质细胞起源肿瘤中1p/19q 杂合性缺失均为联合缺失，1p和19q的单独缺失仅发生在少突-星形细胞起源肿瘤中。在75例中51例(68.0%)少突胶质细胞起源肿瘤及少突-星形细胞起源肿瘤出现IDH1-R132H突变蛋白表达。少突胶质细胞起源肿瘤IDH1-R132H突变蛋白检测阳性率高于少突-星形细胞起源肿瘤。而且少突胶质细胞起源肿瘤及少突-星形细胞起源肿瘤中，IDH1突变蛋白阳性表达与染色体1p/19q 杂合性缺失均有明显相关性(P<0.05)。结论 IDH1-R132H突变蛋白表达是预测少突胶质细胞起源肿瘤及少突-星形细胞起源肿瘤1p /19q 是否杂合性缺失的潜在分子标志物。

【关键词】少突胶质细胞起源肿瘤; 少突-星形细胞起源肿瘤;1p /19q; 异柠檬酸脱氢酶-1; 相关性

[Abstract] Objective To observe the correlation between delection of chromosome 1p/19q and expression of R132H mutant IDH1 status in oligodendroglial tumors, and to explore the molecular markers forecasting chemosensitivity of oligodendroglial tumors. Methods 75 ol igodendrogl ial tumors (38 oligodendrogliomas and 37 oligoastrocytomas). Immunohistochemistry method was used to detect the expression of R132H mutant IDH1 protein， and fluorescence in situ hybridization was carried out to detect the 1p /19q deletion. Results The FISH studies demonstrated that delection of chromosome 1p/19q was in 37 cases(37/75, 49.3%), of which co-deletion were detected in 34 cases.1p and 19q LOH were closely correlated (P<0.01). In oligodendrogliomas (WHOⅡ) cases the deletion rate was slightly higher than in oligodendrogliomas (WHO Ⅲ) cases. There were no statistically significant differences. In oligodendrogliomas (WHO Ⅱand WHOⅢ) cases the deletion rate of chromosome 1p/19q was higher than in oligoastrocytomas (WHOⅡand WHO Ⅲ) cases (P<0.05).The deletion in oligodendrogliomas were all combined deletion, and 1p single deletion and 19q single deletion were only found in oligoastrocytomas. In the 75 cases，the expression of R132H mutant IDH1 was positive in 51 cases，which accounted for 68.0%.In oligodendrogliomas the expression of R132H mutant IDH1 was higher than in oligoastrocytomas. The statistical analysis indicated that there was a correlation between the expression of R132H mutant IDH1 protein and the 1p /19q combined deletion in oligodendrogliomas (P<0.05). Conclusion 132H mutant IDH1 protein is the potential molecular marker forecasting the status of 1p /19q deletion in oligodendrogliomas.

[Keywords]oligodendrogliomas ,oligoastrocytomas,1p/19q, IDH1, correlation

弥漫性胶质瘤是中枢神经系统常见的肿瘤，包括少突胶质细胞瘤、星形细胞瘤、少突星形细胞瘤、胶质母细胞瘤等。其中少突胶质细胞起源肿瘤及少突-星形细胞起源肿瘤(包括少突胶质细胞瘤、间变少突胶质细胞瘤和少突星形细胞瘤、间变少突星形细胞瘤)是弥漫性胶质瘤中的重要类型，虽然少突胶质细胞起源肿瘤及少突-星形细胞起源肿瘤也呈弥漫性浸润生长，但比弥漫性星形细胞瘤有更好的预后。近年来的研究显示少突胶质细胞起源肿瘤的确存在着许多不同于其他胶质瘤类型的分子遗传学改变。1号染色体短臂(1p)和19号染色体长臂(19q)杂合性缺失是其典型的遗传学特征，在星形细胞瘤中这种缺失则很少发生。伴有1p 和19q杂合性缺失的少突胶质细胞起源肿瘤及少突-星形细胞起源肿瘤对化疗较敏感，并有较好的预后。2008年在脑胶质母细胞瘤全基因组测序时次发现异柠檬酸脱氢酶1( isocitrate dehydrogenasel，IDH1) 基因存在突变，并且发生这种突变的继发性胶质母细胞瘤患者的总体生存率较高。有研究表明IDH1突变存在于94%的间变型少突胶质瘤，84%的少突胶质瘤中。由于在少突胶质细胞起源肿瘤及少突-星形细胞起源肿瘤中IDH1突变率较高，是一种与预后相关的因素，因此我们探讨其在少突胶质细胞起源肿瘤及少突-星形细胞起源肿瘤中与1p和19q杂合性缺失的关系，以期寻找到少突胶质细胞起源肿瘤及少突-星形细胞起源肿瘤中与预后相关的分子标志。

材料与方法

1.病例资料：收集三博脑科医院2011年2月至2013年1月少突胶质细胞起源肿瘤及少突-星形细胞起源肿瘤75例，在75 例少突胶质细胞起源肿瘤及少突-星形细胞起源肿瘤中，男性44例，女性31例，年龄范围1~67 岁，平均40岁。诊断标准依据2007 年中枢神经系统肿瘤WHO 分类。其中少突胶质细胞起源肿瘤及少突-星形细胞起源肿瘤包括：少突胶质细胞瘤(WHOⅡ级)、间变型少突胶质细胞瘤(WHOⅢ级) 、少突星形细胞瘤(WHOⅡ级)和间变型少突星形细胞瘤(WHOⅢ级)4种。标本经中性甲醛液固定，常规石蜡包埋，每个组织连续切片4 张，厚度为4 μm，1 张进行HE 染色用于复查确认，1张采用免疫组织化学方法检测IDH1-R132H突变蛋白表达，2 张采用荧光原位杂交(FISH)法检测1p和19q 杂合性缺失。免疫组织化学一抗为鼠抗人IDH1-R132H 抗体(德国Dianova公司);探针为LSI 1p36/LSI 1q25 and LSI 19q13/19p13 Dual Color Probe(美国Vysis公司)。

2.免疫组织化学检测及结果判断：参照免疫组织化学试剂盒操作说明进行，石蜡切片常规脱蜡，过氧化物酶阻断溶液阻断，非免疫性动物血清封闭，微波炉抗原修复，PBS 漂洗后一次滴加鼠抗人IDH1-R132H 抗体(德国Dianova公司)4℃过夜，辣根过氧化物酶标记的二抗37℃ 20 min，链酶亲和素-过氧化物酶溶液10 min，PBS 漂洗后DAB 显色，中性树胶封片，晾干，显微镜下观察。免疫组织化学结果判断由病理科医师完成，结果判定计算每个高倍镜视野内阳性细胞占总观察肿瘤细胞的百分数，取其平均值定义为该标本阳性细胞的百分比，IDH1突变蛋白阳性细胞数 0～10%(-)， 11%～25%(+);26%～50%(++);>50%(+++)。阳性细胞为胞浆着色，呈棕黄色。

3.F I S H检测及结果判断：采用FISH探针LSI lp36/1q25SGn probe和LSI 19p13/19q13 SGn probe(美国Vysis公司)。参照探针说明书进行实验：石蜡切片二甲苯脱蜡处理后自然晾干，预处理液80℃ 30min，去离子水洗1min，缓冲液洗5 min，重复洗2×SSC，37℃胃蛋白酶消化15-20 min，2×SSC洗涤l min;切片放入事先在72℃±1℃预热的变性液中6 min，2×SSC洗涤1min，梯度酒精脱水并自然晾干。避光在杂交区域处加入10 µL探针并盖上盖玻片，加盖22×22 mm盖玻片并用橡胶水泥胶封固盖玻片周边，将切片放入37℃预热湿盒中盖紧盖子，孵育过夜(17 h)，加杂交后缓冲洗液到两个立式染色缸中，其中一个在72℃±1℃水浴箱中预热，另一个放在室温备用，用镊子轻轻把密封在盖玻片周边上的橡胶水泥胶拉起，然后去掉橡胶水泥胶，将切片浸到室温存放的杂交后缓冲洗液中漂洗掉盖玻片。用吸水纸吸掉切片边缘多余的缓冲液，将切片浸到72℃±1℃杂交后缓冲洗液2 min。再在室温清洗30 s，将切片从缓冲洗液中移出，竖立放于暗处，晾干切片。加10μL对比染色的DAPI到切片的靶区盖上盖玻片。避光静置15 min，在荧光显微镜(BX-51，日本Olympus公司)下观察、采集图像。杂交玻片保存于-20℃。荧光原位杂交结果由病理科医师完成，结果判定选择细胞核大小一致、核的边界完整、DAPI 染色均一、细胞核孤立无重叠、对照信号清晰的肿瘤细胞。每例标本随机计数200 个肿瘤细胞，1p36 和19q13分别在两张玻片上检测，其中1p36 检测探针用红色荧光标记，其对照1q25检测探针用绿色荧光标记;19q13检测探针用红色荧光标记，其对照19p13 检测探针用绿色荧光标记。红色信号=绿色信号的细胞评判为正常细胞， 红色信号<绿色信号的细胞评判为缺失细胞。1p36>30%为阳性。19q13 杂合性缺失评判：缺失细胞/正常细胞 比值>30%(图1，2)。同一标本1p36和19q13同时缺失，即1p /19q 联合杂合性缺失。

4.统计学方法：应用SPSS 19.0 统计软件进行分析。用Kruskal-Wallis 秩和检验来分析组间IDH1R132H突变蛋白表达差异，并用Spearman，Pea r son, Kenda l l 等系数进行了Bivariate Correlations的相关性分析， 并作了Binary Logistic的回归与预测，P<0.05被认为差异有统计学意义。

结果

75例少突胶质细胞起源肿瘤及少突-星形细胞起源肿瘤中，少突胶质细胞起源肿瘤38例，其中WHOⅡ级(图1A)和WHOⅢ(图2A)各占19例，少突-星形细胞起源肿瘤37例，WHOⅡ级(图3A)15例，间变少突星形细胞瘤(WHOⅢ级)22例。

1.1p/19q杂合性缺失检测(表1)：75例少突胶质细胞起源肿瘤及少突-星形细胞起源肿瘤中共检出37例(49.3%)1p和/或19q杂合性缺失，其中34例1p杂合性缺失同时伴19q杂合性缺失，二者密切相关(P<0.01)。在少突胶质细胞起源肿瘤(包括WHOⅡ级和WHOⅢ级)中，1p/19q杂合性缺失28例(图1B,1C;图2B,2C)，缺失率73.7%(28/38例)。在少突-星形细胞起源肿瘤中，1p/19q杂合性缺失为9例(图3B,3C)，缺失率24.3%(9/37)，少突胶质细胞起源肿瘤1p/19q缺失率高于少突-星形细胞起源肿瘤(WHOⅡ级和WHOⅢ级，P<0.05)。少突胶质细胞起源肿瘤中1p和19q均为联合杂合性缺失，单独缺失仅发生在少突-星形细胞起源肿瘤中。1p或19q单独杂合性缺失分别占少突-星形细胞起源肿瘤的2.7%(1/37)和5.4%(2/37)。

2.IDH1-R132H突变蛋白检测(表1)：68.0%(51/75)的少突胶质细胞起源肿瘤及少突-星形细胞起源肿瘤出现IDH1-R132H突变蛋白阳性表达。少突胶质细胞起源肿瘤(WHOⅡ级和WHOⅢ级)检出29例IDH1-R132H突变蛋白表达(76.3%)(图1D,2D)，其中间变型少突胶质细胞瘤14例，少突胶质细胞瘤15例，两者之间差异无统计学意义。在少突-星形细胞起源肿瘤中22例(59.5%，22/37)是阳性表达，其中间变型少突星形细胞瘤13例，少突星形细胞瘤(WHOⅡ级)9例(图3)，两者之间差异无统计学意义。少突胶质细胞起源肿瘤(WHOⅡ级和WHOⅢ级)IDH1-R132H突变阳性的29例，略多于少突-星形细胞起源肿瘤(WHOⅡ级和WHOⅢ级)突变阳性的22例，两者之间差异无统计学意义。

3.1p/19q 联合杂合性缺失与IDH1-R132H突变蛋白表达的关系：在1p /19q 联合杂合性缺失的28例少突胶质细胞起源肿瘤中，28例(100%)均为IDH1-R132H突变蛋白阳性表达(图1，2)。在1p/19q 联合杂合性缺失的6例少突-星形细胞起源肿瘤中，6例均为IDH1-R132H突变蛋白阳性表达(表1)。将IDH1突变蛋白阳性细胞数<10%定义为阴性表达，将IDH1突变蛋白阳性细胞数≥10%均定义为阳性表达。检测1p/19q 联合杂合性缺失与否与IDH1-R132H突变蛋白表达做相关性分析。发现在少突胶质细胞起源肿瘤和少突-星形细胞起源肿瘤中1p/19q 联合杂合性缺失与IDH1-R132H突变蛋白的表达明显正相关(P<0.05)。

▲图1A:少突胶质细胞瘤，WHOⅡ级;B：1p缺失;C:19q缺失;D: IDH1R132H突变蛋白表达强阳性

▲图2A:间变性少突胶质细胞瘤，WHOⅢ级;B：1p缺失;C:19q缺失;D:IDH1R132H突变蛋白表达强阳性

▲图3A:少突星形细胞瘤，WHOⅡ级;B：1p缺失;C:19q缺失;D: IDH1R132H突变蛋白表达阳性

讨论

少突胶质细胞起源肿瘤及少突-星形细胞起源肿瘤多在周围脑组织侵袭浸润生长，难以彻底切除，术后的进一步放化疗十分重要。但在实际临床工作，不同的患者对化疗的敏感性各异。目前研究发现，与少突胶质细胞起源肿瘤及少突-星形细胞起源肿瘤化疗敏感性密切相关的是1p /19q杂合性缺失，且在典型少突胶质细胞起源肿瘤中1p缺失常常与19q缺失同时存在。有报道发现存在1p /19q 联合杂合性缺失的间变型少突胶质细胞瘤对PVC(丙卡巴肼，洛莫司汀，长春新碱)化疗敏感，平均生存期可达10年，认为间变少突胶质细胞瘤存在两种具有不同基因改变的的分子亚型，这两种类型有着完全不同的生物学行为。Bauman等发现放疗对1p杂合性缺失者敏感，中位生存期55个月，缺乏1p杂合性缺失者，中位生存期仅半年。因此，1p /19q杂合性缺失是指导临床医师选择少突胶质细胞起源肿瘤及少突-星形细胞起源肿瘤治疗方法及判断预后的较好分子指标，对于少突胶质细胞起源肿瘤及少突-星形细胞起源肿瘤术后治疗有重要意义。有报道在少突胶质细胞起源肿瘤中1p/19q杂合性缺失率为74%。本组病例少突胶质细胞起源肿瘤中1p/19q 的杂合性缺失率为73.7%，与上述报道非常相近。少突胶质细胞起源肿瘤很少表现为单独1p或19q缺失，而非少突胶质细胞起源肿瘤中单独1p或19q杂合性缺失相对常见。本组病例少突胶质细胞起源肿瘤均表现1p和19q联合杂合性缺失，3例1p 和19q单独杂合性缺失均发生在少突-星形细胞起源肿瘤中，1p或19q单独杂合性缺失分别占少突-星形细胞起源肿瘤的2.7%(1 /37例)和5.4%(2/37例)，而且19q单独杂合性缺失比1p 缺失多见。文献报道1p 和19q 的杂合性缺失在少突-星形细胞起源肿瘤中占20%~30%。本组病例少突-星形细胞起源肿瘤缺失率为24.3%，与之结论相近。研究显示1p 和19q的联合杂合性缺失可能是由于19p 到1q 的不平衡转位引起的。

IDH 可促使NADP+转变为 NADPH，NADPH 参与呼吸链正常进行，具有抗氧化和抑制肿瘤作用。研究显示，75%的少突胶质细胞起源肿瘤及少突-星形细胞起源肿瘤均发生IDH1突变，其中IDH1突变均为杂合性突变累及IDH1 132 位精氨酸。Yan等进一步分析发现约 85%少突胶质细胞瘤同时出现1p/19q 缺失和IDH1基因突变。目前，免疫组织化学法检测IDH1-R132H精氨酸突变蛋白表达可准确反应IDH1基因突变情况。朴月善等报道利用针对IDH1-R132H型突变的基因产物的抗体能够特异性的标记肿瘤性胶质细胞，而非反应性增生的胶质细胞。在朴月善等报道的Ⅱ级和Ⅲ级胶质瘤中，含少突胶质细胞瘤成分者阳性率高于单纯的星形细胞肿瘤，结合文献这一结果间接提示IDHI突变与1p/19q 杂合性缺失以及少突胶质细胞肿瘤的发生密切相关。在本组病例中，少突胶质细胞起源肿瘤IDH1-R132H突变蛋白表达(76.3%)高于少突-星形细胞起源肿瘤IDH1-R132H突变蛋白表达(59.5%)，虽然无统计学意义，但结合文献报道，单纯的少突胶质细胞起源肿瘤IDH1-R132H突变蛋白表达要比其他类型胶质细胞瘤表达高。此外我们结合荧光原位杂交检测1p /19q 杂合性缺失情况，分析IDH1-R132H突变蛋白表达与1p/19q 杂合性缺失两者的相关性，发现两种分子病理特征在少突胶质细胞起源肿瘤及少突-星形细胞起源肿瘤中均具有显著相关性。这一结果提示在少突胶质细胞起源肿瘤及少突-星形细胞起源肿瘤中IDH1-R132H突变蛋白高表达一定程度上可预测1p /19q 杂合性缺失。目前FISH 检测1p /19q 杂合性缺失耗时较长，费用较高，尚未广泛推广，因此在无法检测1p /19q 杂合性缺失情况下，可以通过简单易行免疫组织化学方法检测IDH1-R132H突变蛋白的表达，有助预测少突胶质细胞起源肿瘤及少突-星形细胞起源肿瘤中1p /19q 杂合性缺失，帮助少突胶质细胞起源肿瘤及少突-星形细胞起源肿瘤的预后判断。

综上所述，1p/19q 杂合性缺失是少突胶质细胞起源肿瘤及少突-星形细胞起源肿瘤的分子遗传特性之一，与化疗敏感和预后良好有关，IDH1-R132H突变蛋白是少突胶质细胞起源肿瘤及少突-星形细胞起源肿瘤中经常存在的基因改变。本组研究结果显示少突胶质细胞起源肿瘤及少突-星形细胞起源肿瘤中1p/19q 联合杂合性缺失常常伴随IDH1-R132H蛋白突变，两者具有相关性，认为在少突胶质细胞起源肿瘤及少突-星形细胞起源肿瘤中IDH1-R132H突变蛋白表达在一定程度上可以预测1p和19q 联合杂合性缺失情况。

(参考文献略)