【摘要】目的 分析H3K27变异型弥漫性中线胶质瘤(diffusemidlineglioma，H3K27‑altered，DMG)的临床病理学特征及预后相关因素，并探讨神经营养原肌球蛋白受体激酶(neurotrophictropomyosinreceptorkinase，NTRK)作为DMG的治疗靶点的可行性。方法 收集2016年7月至2021年3月首都医科大学三博脑科医院诊断为DMG的病例样本232例，分析其临床、影像、病理、O6‑甲基鸟嘌呤DNA甲基转移酶(MGMT)启动子甲基化比率、NTRK免疫表达、NTRK基因融合的特点，并对肿瘤发生年龄、部位、组织学分级、NTRK蛋白及基因改变、术后辅助治疗方式在预后方面的意义进行研究。结果 232例病例(包含原发/复发病例8例，即共有224例患者，男性118例，女性106例)，儿童组(≤18岁)98例，成人组(>18岁)126例。儿童组和成人组发病部位分别以脑干(59/98，60.2%)和丘脑(41/126，32.5%)最为多见。影像学上病变多呈现为T1低或等信号，T2高信号，增强信号变化较大，但多数肿瘤无明显增强信号。组织学分级包含2级(9/224，4.0%)、3级(41/224，18.3%)、4级(174/224，77.7%)。肿瘤细胞均弥漫表达H3K27M，而H3K27me3均表达丢失。MGMT启动子甲基化比率较低(1/45，2.2%)。Pan‑TRK蛋白阳性率为79.0%(177/224)，NTRK1融合阳性率10.0%(5/50)。儿童组和成人组的组织学分级、NTRK蛋白表达、NTRK基因融合比率差异均无统计学意义(P>0.05)。随访患者159例，其中109例死亡(68.6%)，总体生存时间1~55个月，中位生存期12个月。患者预后与年龄、部位、手术方式及术后辅助治疗相关(P<0.05)。结论 DMG患者临床预后凶险，成人组和儿童组DMG肿瘤的发病部位、预后存在差异。NTRK1基因融合在DMG中占比达10.0%，提示TRK抑制剂可以作为DMG治疗的一个新选择。

【关键词】神经胶质瘤;DNA突变分析;基因融合;预后;H3K27M突变;NTRK融合

胶质瘤是中枢神经系统最常见的原发性脑肿瘤，虽然近年来胶质瘤的各种诊断和治疗手段不断更新，手术策略不断规范，但患者总体生存期仍然无明显提高，尤其是恶性程度较高的H3K27变异型弥漫性中线胶质瘤(diffusemidlineglioma，H3K27‑altered，DMG)2年生存率小于10%。DMG属于儿童型弥漫性高级别胶质瘤，常伴有H3K27me3丢失，出现H3.3/3.1/3.2K27M突变、EZHIP过表达或EGFR突变。过去认为DMG主要发生在儿童，对于儿童DMG的临床病理特征研究相对较多，随着病例数增多，发现成人发病率同样很高，然而，关于H3K27变异型DMG临床病理特点，尤其对于成人和儿童组之间临床特点对比研究相对较少，更是缺乏国内的研究数据。同时，因血脑屏障使得常规化疗药物难以进入肿瘤内部，导致目前胶质瘤化疗效果不甚理想。替莫唑胺的治疗效果很大程度上由肿瘤细胞O6‑甲基鸟嘌呤DNA甲基转移酶(MGMT)启动子甲基化程度决定，但对于H3K27变异型DMG来说，其MGMT启动子甲基化率极低，因此，寻找新的治疗靶点，拓展抗胶质瘤药物治疗途径，同时保证其应用安全性就变得尤为重要。

原肌球蛋白相关激酶(tropomyosin‑relatedkinase，TRK)蛋白是一类神经生长因子受体，属于酪氨酸激酶，TRK蛋白家族由TRKA、TRKB和TRKC蛋白组成，分别由NTRK1、NTRK2和NTRK3编码。这3种TRK蛋白结构相似，与细胞增殖、分化、代谢、凋亡等密切相关。NTRK融合是基因激活改变的主要形式，胶质瘤中有0.31%~2.05%的病例存在NTRK基因融合。TRK抑制剂的Ⅰ/Ⅱ期临床试验表明，在所有NTRK融合阳性肿瘤患者中，TRK抑制剂具有良好的耐受性、有效的中枢神经系统穿透性和良好的客观反应，在非脑干儿童高级别胶质瘤中得到了很好的证实。对于预后极差，缺乏有效治疗手段的DMG，关注NTRK的融合，将为今后DMG的治疗提供一个新的选择。DMG中NTRK融合仅有个别报道，融合比率依然不明。

本研究首先对224例H3K27变异型DMG中的H3.3K27M突变型病例的临床病理学特点和预后进行分析总结，并对全部病例进行Pan‑TRK蛋白的免疫组织化学染色，同时对Pan‑TRK阴性及不同阳性程度组的典型病例进行NTRK1/2/3融合基因的荧光原位杂交(FISH)检测，以明确NTRK融合在DMG中的表达率，以及Pan‑TRK蛋白免疫组织化学染色与NTRK基因融合改变的一致性，以期为未来DMG的NTRK检测的可靠性和药物选择提供依据。

资料与方法

1.资料收集：

筛选首都医科大学三博脑科医院病理科2016年7月至2021年3月间的病理数据库，诊断为H3.3K27M突变型DMG的病例232例，其中有8对为原发/复发病例，本次研究只取用了第一次手术的样本及数据，即纳入研究224例病例。收集患者的临床、影像、病理及随访资料，参照第5版WHO中枢神经系统肿瘤分类标准进行诊断。

2.方法：

手术标本首先由3.7%中性甲醛液固定。免疫组织化学(IHC)标记采用EnVision法，一抗主要包括胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、Olig2、Ki‑67、H3K27M和H3K27me3。上述试剂均为购于北京中杉金桥生物技术有限公司的工作液，GFAP、IDH1R32H定位于胞质，Olig2、H3K27M、H3K27m3、Ki‑67阳性着色定位于细胞核，阳性着色显示为棕黄色。Pan‑TRK免疫组织化学标记采用Ventana法，一抗Anti‑TRK/NTRK(英国Abcam公司)购于RocheDiagnosticsGmbH公司，克隆号EPR17341，稀释浓度为28μg/L，根据试剂说明书在BenchmarkUltra自动染色机上进行染色。选择病变最典型的切片进行免疫染色，同时排除正常脑组织干扰，阴性为无肿瘤细胞着色，阳性定位于肿瘤细胞膜/胞质，≥1%即判读阳性，显示为棕黄色。根据肿瘤阳性细胞的比率及着色强度进行分级：无明显阳性细胞为阴性;阳性细胞颗粒呈浅棕黄色为1+;阳性细胞颗粒介于浅棕黄色和深棕黄色之间为2+;阳性细胞颗粒呈深棕色为3+。

3.FISH：选取Pan‑TRK免疫组织化学表达阴性的9例、均匀呈现1+的11例、2+的11例、3+的19例，分别进行FISH检测，FISH探针NTRK1(1q22‑q23.1)、NTRK2(9q21)、NTRK3(15q25)购于广州安必平医药科技股份有限公司，均为断裂探针，每例样本计数≥200个细胞，计算阳性细胞数与计数细胞数比值，设定cut‑off值≥15%为融合阳性(判读标准按探针说明书推荐，cut‑off值参考文献)。

4.统计学分析：组间差异采用χ2检验和Fisher精确检验。生存数据采用log‑rank检验进行Kaplan‑Meier分析组间差异，使用SPSS26.0和GraphPadPrism7进行统计学分析。P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1.临床资料：(1)临床特征：224例病例中女性为106例，男性为118例，男女比例为1.0∶0.9。年龄分布3~71岁，中位年龄22岁。224例肿瘤均发生在中线部位，多为单病灶累及(178例，79.5%)，其中脑干89例(89/178，50.0%)，丘脑及基底节区55例(55/178，30.9%)，脊髓18例(18/178，10.1%);少见部位13例(13/178，7.3%)，包括小脑4例，鞍区3例，第三脑室及三脑室后各3例。罕见部位3例(3/178，1.7%)包括三角区、松果体区、侧脑室各1例。46例(20.5%)为颅内多发病灶。其中45例进行了MGMT启动子甲基化检测，仅有1例呈现MGMT启动子甲基化阳性(1/45，2.2%)。(2)成人组和儿童组DMG临床特征：成人组126例(56.2%)，男性71例，女性55例，年龄分布19~71岁，中位年龄33岁;儿童组98例(43.8%)，男性47例，女性51例，年龄分布3~18岁，中位年龄11岁。成人组和儿童组均以单病灶累及最为常见。成人组主要以丘脑最多见41例(41/126，32.5%)，其次是脑干30例(30/126，23.8%)、脊髓10例(10/126，7.9%)及其他罕见部位;儿童组主要以脑干59例(59/98，60.2%)最为多见，其次为丘脑12例(12/98，12.2%)、脊髓8例(8/98，8.2%)及其他少见部位，两组之间肿瘤发病部位差异有统计学意义(P<0.05，表1)。

2.病理学特征：本研究选择的病例为H3.3K27M突变型DMG，不包括H3.1/3.2及其他2种分子改变的DMG。形态学均为浸润性星形细胞胶质瘤，其中2级的肿瘤9例(4.0%)，肿瘤细胞密度较低，呈圆形、卵圆形或短梭形，胞质相对较丰富，部分可见胞质突起，核染色淡，核分裂象罕见或不见(图1A);3级的肿瘤41例(18.3%)，肿瘤细胞密度明显增高，细胞异型性显著，常呈多形性改变，核质比高，并可见怪异核，核分裂象活跃，但无微血管增生及坏死(图1B);4级的肿瘤174例(77.7%)，除了具有3级肿瘤的细胞形态学特征外，同时伴随微血管增生和/或肿瘤的坏死(图1C)，肿瘤坏死可为小灶状、栅栏状或片状不等。224例的肿瘤细胞均弥漫性GFAP胞质阳性表达，Olig2和H3K27M(图1D~F)核阳性表达，反应增生的胶质细胞及血管内皮H3K27M均为阴性。H3K27me3肿瘤细胞核缺失表达(图1G~I)，作为内对照的肿瘤间质内的血管内皮细胞及反应性增生胶质细胞阳性表达，IDH1R132H均为阴性。Ki‑67在2级的肿瘤中，阳性指数1%~5%，3级和4级肿瘤的阳性指数比例跨度比较大，往往在10%~50%之间不等。儿童组与成人组病理组织学分级比例差异无统计学意义(表1)。

3.影像资料：影像学特征变化差异较大，患者均于术前进行磁共振成像(MRI)，显示肿瘤位于中线部位，以累及脑干、丘脑及基底节、脊髓者多见，占72.3%(162/224)。组织学级别为2级、3级或4级的DMG均呈现边界不清，MRI通常显示等T1/稍低T1信号影、高T2信号、稍高Flair信号，增强扫描缺乏规律，多数肿瘤强化并不明显，而且增强信号与肿瘤组织学级别无关。其中组织学级别为3级的DMG呈现强化，也可以不出现强化，组织学级别为2级的DMG也可以呈现强化。不同组织学级别的典型的影像学如图2。

4.Pan‑TRK蛋白免疫组织化学染色：对224例DMG进行Pan‑TRK蛋白免疫组织化学染色，其中阴性47例(组织学2级5例、3级12例、4级30例)，阳性表达1+的82例(组织学2级2例、3级19例、4级61例)，阳性2+的54例(组织学2级1例、3级4例、4级49例)，阳性3+的41例(2级1例、3级6例、4级34例;图3)。其中儿童组98例，成人组126例，两组之间Pan‑TRK蛋白免疫组织化学染色比例差异无统计学意义(表1)。

5.NTRK FISH 检测结果：选择 Pan‑TRK 蛋白 免疫组织化学阴性及不同阳性程度的 50 例样本进行 FISH 检测，其中免疫表达阴性的 9 例，1+ 和 2+ 的 各 11 例、3+ 的 19 例。在检测的样本中，我们只观 察 到 了 NTRK1 的 断 裂， 而 NTRK2 和 NTRK3 没 有断裂阳性的病例。NTRK1(1q22‑q23.1)融合阳 性 10.0%(5/50)， 其 中 Pan‑TRK 蛋 白 免 疫 表 达 1+ 的病例中 NTRK1 融合阳性 2/11、2+ 的病例中 NTRK1 融合阳性 3/11、而免疫表达阴性和表达 3+ 的病例中无 NTRK1 融合阳性(0/28)。儿童组病 例 NTRK 融合阳性为 5(5/26，19.2%)，成人组无 NTRK 融合阳性病例，两组中的 NTRK 融合比率差 异无统计学意义(表 1)。同时，还发现 50 例样本中， 28 例观察到 NTRK1/2/3 基因位点拷贝数不同程度及 不同组合扩增，并且均发生于组织学 4 级样本。典型 的 NTRK1 融合阳性、NTRK2 融合阴性及 NTRK3 融合阴性及存在拷贝数扩增如图 4 所示。

6. 随 访 和 预 后： 本 组 224 例 患 者， 随 访 到 患 者 159 例， 成 人 91 例(57.2%)， 儿 童 68 例 (42.8%)。在随访病例中，中位生存期 12 个月， 2 年生存率 25.5%;其中儿童中位生存期 9 个月，2 年生存率 20.8%，成人中位生存期 13 个月，2 年生 存率 28.8%。成人组预后优于儿童组(P<0.05，图 5A)。在具有随访数据的病例中，按部位分组分析 预后，组间差异有统计学意义(P<0.05，图 5B)。 其中丘脑的 DMG(35 例)中位生存期 17 个月，而 发生在脑干的 DMG(67 例)中位生存期 9 个月。 组织学分级、Pan‑TRK 蛋白免疫组织化学表达和 NTRK 基因融合与预后无统计学相关性。所有具有 相关预后随访数据的患者中：穿刺活检组(18 例， 中位生存期 6 个月)和手术切除组(141 例，中位 生存期 12 个月)相比预后较差(P<0.05)。放疗组(4 例)中位生存期 26 个月，放疗 + 化疗组(74 例) 中位生存期 22 个月，化疗组(12 例)中位生存期 12 个月，未做治疗组(51 例)中位生存期 3 个月， 实施辅助治疗组内，包括放疗组、放疗 + 化疗及化 疗组三组之间预后差异无统计学意义(P>0.05)， 但比未做治疗组病例预后好(P<0.05，图 5C)。

讨  论

DMG 属于 2016 WHO 中枢神经系统肿瘤分类 中命名的一个实体肿瘤类型，包括组蛋白变体 H3.3 和 H3.1/3.2 基因的典型 H3K27M 突变。随后的研 究还显示 DMG 还存在 EZHIP 过表达和 EGFR 变 异 2 种亚型，在 2021 年 WHO 中枢神经系统肿瘤 分类中将他们统称为 H3K27 变异型 DMG。该类肿 瘤预后差，且治疗方法极其有限，数十年的临床试 验结合了常规化疗和放疗，仍未能改善预后。因此 需要更多的临床数据来增强对这种肿瘤的认识。我 们通过 H3.3K27M 突变型 DMG 的病例，对其临床、 组织病理学和潜在用药靶点 NTRK 融合等的分子特 征、预后进行了分析，特别是对成人组和儿童组患 者进行了对比分析。

224 例肿瘤患者，男女比例相近，无明显性别 倾向。肿瘤均发生在中线部位，其中以脑干(89 例， 39.7%)最为多见，其次为丘脑及基底节(55 例， 24.6%)和脊髓(18 例，8.0%)。并且随部位不同 预后存在差异性，发生在丘脑的病例预后(中位生 存期 17 个月)好于发生在脑干部位的病例(中位生 存期 9 个月)，这与文献报道一致。并且组织学级 别中包含了 2 级、3 级和 4 级的病例，其中 4 级病 例(174 例，77.7%)占比最高，其次为 3 级和 2 级， 分别为 41 例(18.3%)和 9 例(4.0%)。不同分 级间预后无显著差异。DMG 影像特点变化多样， 虽然 T1 多呈低信号或等信号、T2 高信号，但对比 增强后的信号差异很大，许多 DMG 肿瘤缺乏对比 增强信号，术前 MRI 多样化给 DMG 诊断带来了更 多的难度，这与以往报道一致。

我们对 224 例病例研究显示，成人组 126 例 (56.2%)，儿童组 98 例(43.8%)，成人病例比 率略高于儿童病例，这和华西医院团队的研究相近。 他们的病例 Kaplan‑Meier 分析表明，成人患者的 预后优于儿童组队列，我们数据也证实成人组(中 位生存期 13 个月)预后明显优于儿童组(中位生存 期 9 个月)。我们认为这可能与成人组和儿童组发 病部位的差异性相关，儿童组发病部位主要以脑干 为主，而成人组发病部位主要以丘脑最为多见，两 组发病部位存在统计学差异。替莫唑胺是目前治疗 脑肿瘤的相对有效药物，但 DMG 的 MGMT 启动 子甲基化比率极低(1/45，2.2%)，这就导致替莫 唑胺的疗效有限，迫切需要寻找有针对性的其他药 物靶点。TRK 抑制剂已经开始尝试治疗中枢神经系 统肿瘤，如拉曲替尼和恩曲替尼的疗效已在非脑干 儿童高级别胶质瘤中得到证实。美国 FDA 于 2019 年首次批准恩曲替尼用于 NTRK 基因融合的成人和儿童实体肿瘤的治疗。而且恩曲替尼更具穿越血脑屏障的能力。NTRK 融合阳性 DMG 使用 NTRK抑制剂的体外试验也取得了较好的效果，并且在临床高级别胶质瘤治疗中也显示惊喜临床经过。了解DMG 中NTRK 基因融合发生率可为今后指导 TRK抑制剂在 DMG 中的治疗选择提供理论依据。我们选取 50 例样本行 FISH 检测，发现 41 例阳性样本中有 5例 (12.2%) 存在 NTRK 融合，而9 例阴性样本均无 NTRK 融合，虽然免疫组织化学染色强度与 NTRK 融合没有明确的相关性，但可以从侧面反映出 Pan-TRK 蛋白免疫组织化学阴性者不存在 NTRK 融合，可作为 FISH 检测的初筛。文献认为 Pan-TRK 蛋白免疫组织化学染色可以作为大多数肿瘤有效初筛手段，但遗憾的是，由于 NTRK在神经组织中也有表达，导致其对中枢神经系统肿瘤的特异性较低。Solomon 等发现在胶质瘤中利用 Pan-TRK 蛋白表达判断其融合的特异性约为20.8%，因此在这种情况下应避免免疫组织化学筛查，或极其谨慎使用，需要其他技术的确认。我们结论与文献相同，FISH 或其他测序的方式可能更好筛选出 DMG 中的 NTRK 融合的病例。此外，统计分析，儿童组 NTRK 融合率与成人组 NTRK 融合率之间差异无统计学意义，提示在 DMG 中NTRK融合比率与年龄无关。同时，NTRK 融合可以发生在 DMG 肿瘤中，虽然比率较低，但其可以作为TRK 抑制剂潜在治疗的靶点。

总结患者预后，未进行手术切除/穿刺活检的患者预后差于手术切除的患者，提示手术切除对延长患者预后有积极意义。辅助治疗方式之间对于生存期影响无差异，但其预后均优于未进行辅助治疗组的预后。因此，DMG术后行辅助治疗还是非常必要的。本研究评估成人组和儿童组H3.3K27M突变型DMG的临床病理特征和预后，除了进一步证实成人DMG预后优于儿童，DMG的预后与部位相关外，还发现DMG组织学级别与预后无明显相关性。DMG中MGMT启动子甲基化比率极低，这大大限制了替莫唑胺的作用，我们发现NTRK融合可以发生在DMG肿瘤中，虽然比率较低，但其可以作为TRK抑制剂潜在治疗的靶点，成为替莫唑胺之外新的选择方向。对于TRK抑制剂的临床试验将持续进行，并且将涵盖更多的病例，以期为DMG患者找到一丝曙光。(参考文献略)